JLBA MEDICAL

J.L. Brunet (1), F. Fatoohi (2), A. Perret Liaudet (3) and G.J.N. Cozon (2)

Service des Maladies Infectieuses Hôpital de la Croix-Rousse Lyon France
Laboratoire d'Immunologie Hôpital de la Croix-Rousse Lyon France
Laboratoire de Neuro-Chimie Hôpital Neurologique Bron France

Ce travail a pu être réalisé grâce à l'aide des Hospices Civils de Lyon AO95 France et des Laboratoires Boiron de Sainte Foy les Lyon (France).

Remerciements : C. Ghaemmaghami pour son aide (laboratoire de neuro-chimie).

Dr. J.L.Brunet
Service des Maladies Infectieuses
Hôpital de la Croix-Rousse
69317 Lyon Cedex 04 France.
Tel : 33 (0)4 72 07 17 48
Fax : 33 (0)4 72 07 17 50
e-mail : jean.louis.brunet@libertysurf.fr

Résumé

Le syndrome de fatigue chronique ou encéphalopathie myalgique est l'objet de multiples descriptions et de travaux. Sur le plan immunologique, de nombreuses anomalies ont été décrites sans qu'aucune ne soit actuellement caractéristique.

La présente étude montre l'existence d'une réactivité cellulaire de type retardé anormale vis-à-vis de certains antigènes habituels de l'environnement dans pratiquement un cas sur deux.

Ceci peut être mis en évidence par l'intradermoréaction utilisant des antigènes commensaux comme les levures de type Candida albicans associée à la réaction syndromique survenant dans les 6 à 48h suivantes,

Ceci est conforté de façon très significative par la mesure en cytométrie en flux de l'activation des lymphocytes en présence de Candida albicans utilisant les techniques de triple marquage CD3 CD4 CD69 et 25, et par le suivi de la cinétique urinaire de la néoptérine avant et après intradermoréaction.

L'activation cellulaire paraît d'autant plus marquée que l'IDR est plus importante.

Différents facteurs pouvant contribuer à l'état de fatigue ont été mis en évidence chez plusieurs patients, comme notamment des troubles du sommeil, sans qu'il soit évident d'établir une relation de cause à effet dans un sens ou dans l'autre.

Cette étude va dans le sens d'une approche multi-factorielle des syndromes dits de " fatigue chronique ".

Mots clés : syndrome de fatigue chronique , hyper réactivité.

Abstract

Chronic fatigue syndrome or benign myalgic encephalomyelitis has been extensively described and investigated. Although numerous immunological abnormalities have been linked with the syndrome, none have been found to be specific.
This article describes the detection of delayed-type hypersensitive responses to certain common environmental antigens in almost fifty per cent of patients with this syndrome.
Such hypersensitivity can be detected by the intradermal administration of antigens derived from commensal organisms like the yeast Candida albicans, and then monitoring for a systemic reaction over the following six to forty-eight hours.
This approach can be consolidated by performing lymphocyte activation tests in parallel and measuring in vitro T-cell activation by Candida albicans antigens by three-colour flow cytometry based on CD3, CD4 and either CD69 or CD25. Another useful parameter is the kinetics of neopterin excretion in the urine over the course of the skin test.
The results showed that the intensity of the DTH response correlated with the number of T-cells activated in vitro.
Various factors have been implicated in the fatigue of many patients, notably lack of sleep. However, it remains difficult to establish causality in either one direction or the other.
This work is in the spirit of a multifactorial approach to the group of conditions referred to as "chronic fatigue syndrome".

Key-words : chronic fatigue syndrome, hypersensitivity.

Introduction

Le syndrome de fatigue chronique ou encéphalopathie myalgique est l'objet de multiples descriptions dans la presse médicale et les médias. Malgré la multitude des travaux qui lui sont consacrés, la plupart des questions posées à propos des étiologies, du mécanisme, du traitement, voire de la réalité de ce syndrome n'ont pas reçu de réponse définitive.
Cette entité recouvre en fait probablement différentes causes, sans qu'elles soient nécessairement indépendantes les unes des autres (1).
Sur le plan immunologique, de nombreuses anomalies ont été décrites sans qu'aucune ne soit actuellement caractéristique (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9).
Nombre d'auteurs incriminent le rôle d'agents infectieux, virus notamment au moins comme agent déclenchant possible d'une partie des symptômes (10, 11, 12, 13).
Ces résultats sont pour l'instant fragiles, compte tenu de la diversité des anomalies décrites, des difficultés de dosage et des incertitudes qui entourent les médiateurs mis en cause (14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22).
Dans certaines pathologies liées à un état d'hyper réactivité de l'immunité, dont certaines sont bien connues comme, par exemple, la brucellose chronique afocale (23, 24), le tableau clinique réalise un syndrome d'hyper réactivité de l'organisme vis à vis des antigènes de brucelles, au premier rang duquel on retrouve un état de fatigue, parfois très invalidant, des algies musculaires et articulaires et des troubles neurovégétatifs variés qui perturbent considérablement l'existence et l'activité professionnelle.
Ceci est parfois à l'image de ce que l'on observe dans le syndrome de fatigue chronique.
Ceci est retrouvé de la même façon chez des patients hyper réactifs à certains antigènes de l'environnement comme les candidas (25) ou certains microbes, notamment les staphylocoques (26).
Ces patients présentent des réactions syndromiques à l'injection intradermique des antigènes en cause; il s'agit d'une réactivation ou d'une exacerbation des symptômes observés, faisant suspecter une anomalie de la sensibilité à ces antigènes.
Dans une étude récente chez les patients hyper réactifs à l'antigène candidosique, nous avons montré que les patients qui présentent une réaction syndromique à l'intradermoréaction (IDR) à cet antigène, possèdent un nombre anormalement élevé, dans le sang périphérique de lymphocytes T circulants activables par le même antigène. Ces lymphocytes T sont détectés, après 24 heures d'incubation, en cytométrie en flux par un marquage de l'antigène membranaire CD69 (27).
Nous avons ainsi pu constater chez un premier groupe de 44 patients venus à notre consultation avec un diagnostic initial de syndrome de fatigue chronique, qu'il semblait effectivement exister, pour pratiquement la moitié d'entre eux, une réactivité anormale aux antigènes staphylococciques et candidosiques avec réaction syndromique (27 cas/44) à la suite des tests cutanés et réponse confirmative en test d'activation lymphocytaire (24 cas/44) avec une corrélation très significative (28).
Une réactivité anormale à des antigènes de l'environnement pourrait-elle donc être incriminée chez certains de ces patients présentant un syndrome de fatigue chronique ?
Pour tenter de répondre à cette question, nous avons étudié sur une période de 6 mois, 1 série de 67 patients venus à la consultation de notre service avec un diagnostic initial de syndrome de fatigue chronique.

Matériels et méthode

Patients

67 patients (30 hommes et 37 femmes) de 18 à 65 ans venus à la consultation du service avec un diagnostic de syndrome de fatigue chronique ont été inclus dans l'étude, après consentement éclairé, entre juillet 2000 et mai 2001.

Un premier questionnaire d'ordre général a tout d'abord été rempli de façon à préciser la genèse et le type des symptômes ressentis par les patients et notamment leur état de fatigue.

Un second questionnaire leur a été proposé afin d'évaluer le degré des principaux symptômes allégués pendant les 7 jours précédents et les 7 jours suivants l'IDR de façon à caractériser une éventuelle réaction syndromique.

Le questionnaire proposé comprenait 3 échelles cotées de 0 (rien) à 6 (maximum) à situer en fonction de l'importance des symptômes ressentis quotidiennement par les patients de façon à préciser successivement l'importance de la fatigue, des douleurs et enfin des symptômes spécifiques de chacun.

Un bilan biologique a été réalisé avec, en particulier, NF CRP, bilan hépatique et urinaire, dosages hormonaux, recherche d'allergie de type immédiat de même qu'un bilan immunologique global avec notamment différentes sérologies virales et une étude des sous populations lymphocytaires, un électrophorèse des protéines, une étude des fractions du complément et un dosage des différentes classes d'immunoglobulines.

L'évaluation du profil psychique a été réalisé à l'aide d'un auto-questionnaire de Beck rempli par chaque patient.

Pour les tests cutanés, compte tenu de l'absence de réactivité habituelle aux antigènes staphylococciques en IDR, nous avons choisi de n'utiliser qu'un extrait de Candida albicans (C. albicans).

30 microlitres d'un extrait de C. albicans à 100mg/ml fourni par le laboratoire Allerbio ont été injectés en intradermique.

La réaction cutanée a été notée au bout de 48 heures de même que l'existence ou non d'une réaction syndromique.
Test d'activation des lymphocytes

Les tests d'activation des lymphocytes ont été réalisés en cytométrie en flux avec triple marquage CD3 CD4 et CD69 (marqueur précoce) d'une part, CD3 CD4 et CD25 (marqueur tardif) d'autre part.

En résumé, les cellules sanguines sont collectées après 24h de cultures (50 microlitres de sang complet sont incubés à 37° en CO2 (5%) avec soit 50 microlitres des dilutions de l'antigène C.albicans dans du RPMI 1640, soit du RPMI 1640 seul, contrôle négatif) pour la détermination de l'expression du CD69 et après 7 jours pour la détermination de l'expression du CD25.

Après lyse des globules rouges, les leucocytes sont colorés en utilisant une combinaison anticorps, CD4-phycoerythrine, CD3-cyanin-5-phycoerytrine et CD69-fluorescéine isothiocyanate ou CD25 (Dako laboratoires). La lecture en cytométrie en flux s'effectue sur un cytomètre Fascan (Becton Dickinson).

Chez le sujet sain, moins de 1 % des lymphocytes non stimulés expriment spontanément le CD69 (6, 8, 9, 25); les patients présentant plus de 1% de cellules T exprimant spontanément le CD69 ont été exclus de cette étude.

L'activation a été considérée comme positive quand plus de 2% des cellules T CD3+ activées par C.albicans expriment le CD69 (23).
Dosage de la néoptérine urinaire

Une étude de la cinétique de la néoptérine urinaire a enfin été effectuée avec recueil d'un échantillon des urines du matin, chaque matin en commençant 2 jours avant l'IDR et pendant les 5 jours suivants.

La néoptérine est produite par stimulation des macrophages par l'interféron gamma (29); elle est utilisée comme marqueur biologique de stimulation de l'axe lymphocytes T/interferon-gamma/macrophages.

La néoptérine et la créatinine sont mesurées simultanément au cours de la même séparation chromatographique.

La néoptérinurie a été mesurée par fluorescence après séparation en chromatographie liquide haute performance, CLHP (30). Les échantillons sont injectés sur une colonne C18 en phase inverse (3m, 250*3mm Inertsil ODS 3â, GL Sciences, Japon, Interchim France). La néoptérine est éluée à un débit de 0,43ml/mn avec une phase mobile contenant un tampon phosphate à 15 mmol/l, pH : 6,4 et 0,5% d'acétonitrile.

Tous les échantillons d'un même patient sont analysés dans la même série.

La créatininurie a été conjointement déterminée à 235 nm après séparation CLHP.

Les résultats sont exprimés en nmol de néotpérine par mmol de créatinine.

Le coefficient de variation intra essai (CV) était de 6,4% (13,75 nmol /mmol +- 1,23, n=25) et le CV inter essai était de 6,3% (13,05 nmol/mmol +-0,82 , n=24).
Analyse de données

La comparaison des réactions cutanées de type retardé entre les patients avec ou sans réaction syndromique, TAL positif ou négatif, cinétique de la néoptérine urinaire modifiée ou non, a été réalisée en utilisant un test de Student (logiciel Statview, Abacus Berkeley,CA). Les données sont présentées comme la moyenne des valeurs +-SEM (erreur standard).

Resultats

Patients

Les principaux symptômes cliniques sont rapportés dans le tableau 1. Dans tous les cas, les patients avaient effectué antérieurement différents bilans sans résultat.

Tableau 1 : principaux aspects cliniques.
Dans 9 cas, il a été mis en évidence une pathologie spécifique non diagnostiquée antérieurement pouvant être responsable de la fatigue et des troubles allégués :
- 1 spondylarthrite ankylosante
- 2 hépatite auto-immune
- 6 déficits en magnésium érythrocytaires
Pour 3 de ces patients, il a été trouvé une réactivité anormale associée (test d'activation des lymphocytes et dosage de la néoptérine urinaire).

A noter la constatation de troubles du sommeil avérés (apnée ou désynchronisation du sommeil) chez 3 patients ayant pu bénéficier d'un examen polysomnographique durant la présente étude, dont 2 ayant un test d'activation des lymphocytes positif avec modification de la néoptérine urinaire lors de l'IDR).

Une réaction syndromique a été déclenchée dans les 6 à 48 heures à la suite de l'injection intradermique d'antigène C.albicans dans 42 cas sur 67 (réaction d'amélioration dans 1 cas, réaction d'aggravation dans les autres cas).
Test d'activation des lymphocytes

Les résultats du test d'activation des lymphocytes ont été les suivants :
- 40 tests positifs dont 37 chez les patients ayant eu une réaction syndromique, 3 seulement ayant été observé chez un patient n'ayant présenté aucune réaction syndromique.
- 27 tests négatifs dont 22 chez des patients n'ayant présenté aucune réaction syndromique.
- 5 patients ont présenté une réaction syndromique avec un test d'activation des lymphocytes négatif.
Ces résultats sont bien montrés dans le tableau 2.

Tableau 2 : corrélation réaction syndromique - test d'activation des lymphocytes.
L'étude des sous populations lymphocytaires montre la présence de cellules CD4+ activées par l'antigène C. albicans en nombre anormalement élevé dans le sang périphérique (marqueur précoce CD 69) avec un pourcentage de cellules d'autant plus important que l'intradermoréaction a été plus forte comme le montre la figure 1.

Pourcentage de cellules T CD4 CD69+activées

Figure 1 : test d'activation des lymphocytes ; pourcentage de cellules CD4+ CD69+ activées en présence de Candida albicans selon le degré de l'intradermoréaction.
Ceci est retrouvé de la même façon avec le marquage CD 25 comme le montre les figures 2 et 3.

Pourcentage de cellules T CD3 CD25+activées

Figure 2 : test d'activation des lymphocytes ; pourcentage de cellules CD3+ CD25+ activées en présence de Candida albicans selon le degré de l'intradermoréaction.

Pourcentage de cellules T CD4 CD25+activées

Figure 3 : test d'activation des lymphocytes ; pourcentage de cellules CD4+ CD25+ activées en présence de Candida albicans selon le degré de l'intradermoréaction.
Dosage de la néoptérine urinaire

L'IDR s'est accompagnée d'une augmentation de la néoptérine urinaire dans 39 cas.

Dans 37 cas, cette modification a été observée dans le même temps qu'une réaction syndromique.

2 patients ont eu une modification de leur taux de néoptérine urinaire sans que l'intradermoréaction n'ait entraîné de réaction syndromique.

Dans 5 cas, inversement, l'intradermoréaction a entraîné une réaction syndromique sans modification de la cinétique de la néoptérine urinaire.

Ces résultats sont montrés dans le tableau 3.

Tableau 3 : corrélation réaction syndromique - cinétique de la néoptérine urinaire.

Discussion

L'analyse des différentes données cliniques met en avant la fatigue particulière et les douleurs alléguées par l'ensemble des personnes vues en consultation.

La recherche d'une réactivité cellulaire anormale dirigée contre l'un des antigènes habituels de l'environnement est apparue positive dans un nombre élevé des cas étudiés, pratiquement un cas sur deux.

La valeur diagnostique des tests utilisés, tant pour le test d'activation lymphocytaire que pour l'étude de la cinétique de la néoptérine urinaire, paraît très intéressante avec des pourcentages situés entre 88 et 95% pour la sensibilité, la spécificité et la valeur prédictive positive comme montré dans les tableaux 2 et 3.

Ceci rejoint l'estimation faite dans l'étude préliminaire où nous avions trouvé une réactivité anormale des cellules T vis à vis des antigènes microbiens staphylocoques notamment, et des levures du genre C.albicans dans pratiquement également la moitié des cas.

Le rapprochement de ces observations avec l'aspect bien connu des manifestations cliniques observées dans les états d'hypersensibilité cellulaire de type retardé pathologique comme les brucelloses chroniques afocales ou les staphylococcies ou candidoses chroniques, liées à un état d'hyper réactivité de l'immunité, pourrait faire évoquer une telle participation dans certains de ces syndromes dits de " fatigue chronique ".

Dans plusieurs de nos observations, nous avons pu constater l'existence de facteurs associés pouvant contribuer également à l'état de fatigue tout particulièrement marqué présenté par ces patients, comme un déficit en magnésium érythrocytaire ou des troubles variés du sommeil.

Conclusions

La recherche d'un état d'hyper réactivité cellulaire de type retardé pathologique pourrait faire partie du bilan réalisé devant tout patient présentant un syndrome de fatigue chronique.

L'intradermoréaction, associée à la réaction syndromique survenant dans les 6 à 48h suivantes, utilisant des antigènes habituels de l'environnement comme les levures de type C.albicans permet de mettre en évidence l'existence d'une réactivité anormale chez pratiquement la moitié des patients.

Ceci est conforté de façon très significative par la mesure en cytométrie en flux de l'activation des lymphocytes en présence de C.albicans utilisant les techniques de triple marquage CD3 CD4 CD69 et 25, et par le suivi de la cinétique urinaire de la néoptérine avant et après intradermoréaction.

L'activation cellulaire paraît d'autant plus marquée que l'IDR est plus importante.

Différents facteurs pouvant contribuer à l'état de fatigue ont été mis en évidence chez plusieurs patients, comme notamment les troubles du sommeil, sans qu'il soit évident d'établir pour l'instant, une relation de cause à effet dans un sens ou dans l'autre.

Cette étude va dans le sens d'une approche multi-factorielle des syndromes dits de " fatigue chronique ".

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